Методы исследований и контрастирования

Метод темного поля

Основан на эффекте, который достигается освещением объекта полым конусом света, внутренняя апертура которого должна превосходить числовую апертуру применяемого объектива. Таким образом, ни один прямой луч не попадает в объектив: при отсутствии объекта поле зрения микроскопа будет темным, а при его наличии — контрастный светлый объект будет виден на темном фоне в отраженном или рассеянном (диффузно отраженном) свете.
      Для создания темного поля в биологическом микроскопе применяют:

• щелевой метод;
• упрощенный метод, связанный с одновременным диафрагмированием осветительной апертуры конденсора и выходной апертуры объектива, при этом объектив должен иметь ирисовую диафрагму или вкладыш, которые позволяют уменьшать выходное отверстие объектива, приближая его к осветительной апертуре, оптимальной для получения эффекта темного поля;
• специальный конденсор темного поля.

Метод исследования в темном поле впервые был предложен австрийскими учеными Р.Зигмонди и Р. Зидентопфом в 1903 г.

Метод фазового контраста

Метод связан с изменением условий освещения при наблюдении слабоконтрастных биологических объектов (микроорганизмов, растительных клеток) в неокрашенном состоянии с целью их визуализации (контрастирования). В отличие от метода темного поля, выявляющего лишь контуры объекта, метод фазового контраста позволяет увидеть элементы внутренней структуры рассматриваемого прозрачного объекта. Устройство дает возможность преобразовывать фазовые изменения световых волн, проходящих через объект, в амплитудные, в результате чего прозрачные микроорганизмы становятся видимыми.

В зависимости от размера фазовых колец и способа их получения различают:

• положительный фазовый контраст, когда фазовое кольцо в объективе технологически получается путем травления, что вносит «опережение» в прямо прошедший свет, при этом изображение объекта с показателем преломления большим, чем у среды, получается темнее на более светлом фоне;
• отрицательный фазовый контраст (аноптральный или темнопольный фазовый контраст), когда фазовое кольцо в объективе технологически получается путем нанесения на поверхность стекла тонкой пленки, что вносит «запаздывание» в прямо прошедший свет, при этом изображение объекта с показателем преломления большим, чем у среды, выглядит светлее окружающего темного фона.

Метод может быть реализован двумя способами:

• расположением элементов с фазовым и световым кольцами внутри оптических систем объектива и конденсора, соответственно;
• расположением этих элементов вне объектива и окуляра внутри самого микроскопа.

Первый способ реализуется с помощью фазово-контрастных устройств, содержащих фазовые объективы и специальный конденсор с набором световых колец (встроенных в конденсор или выполненных в виде вкладышей). Приобретаются отдельно от микроскопа. Второй способ реализуется с помощью соответствующих колец, которые устанавливаются в плоскости апертурной диафрагмы конденсора и в вынесенную с помощью дополнительных линзовых элементов плоскость выходного зрачка объектива. При этом и конденсор, и объектив — обычные. Чаще всего этот способ реализуется в современных инвертированных микроскопах.

Фазовые объективы
Внутри имеют фазовый элемент (линза или пластина) с нанесенным кольцом, которое изменяет фазу и уменьшает амплитуду световой волны. Середина кольца в среднем составляет 1/2—2/3 от диаметра выходного зрачка объектива при этом светопропускание кольца — 10—30% в зависимости от типа фазового контраста.

Фазовый конденсор
в плоскости апертурной диафрагмы имеет пластину с прозрачным световым кольцом. Размер светового кольца, вернее его изображение, подбирается таким образом, чтобы оно соответствовало (или даже было чуть меньше) размеру фазового кольца объектива. В современных микроскопах существует два способа установки световых пластин в конденсор:

• в плоскость апертурной диафрагмы конденсора устанавливается съемный вкладыш для соответствующего объектива (обычно вкладыш представляет собой черную пластмассовую деталь с прорезанным световым кольцом);
• используется револьверное устройство, закрепленное на конденсоре; имеется несколько гнезд — одно пустое — для светлого поля и 3— 4 гнезда со стеклянными пластинами, на которых с помощью маски получено световое кольцо.

Исследование в поляризованном свете

Метод связан с визуализацией объекта или его элементов в поляризованном свете в результате изменения направления поляризации света и проявления анизотропных свойств объекта. Особенностью поляризационных микроскопов является наличие в оптической схеме поляфильтров: в осветительной части — поляризатора, а в промежутке между объективом и окуляром — анализатора. Наблюдение производится тогда, когда оба поляфильтра развернуты друг относительно друга, и при этом в выходном зрачке микрообъектива наблюдается максимальное затемнение.

Исследования в свете люминесценции

Метод основан на наблюдении микроскопических объектов с использованием их способности к свечению. Метод основан на наблюдении микроскопических объектов с использованием их способности к свечению. По сравнению с методами обычной микроскопии исследование в свете люминесценции обладает рядом преимуществ: цветное свечение, высокая степень контрастности светящихся объектов на темном фоне, возможность исследования как прозрачных, так и непрозрачных живых объектов, а также различных жизненных процессов в динамике их развития, обнаружения и установления локализации отдельных микробов и вирусов.

В медицинской микробиологии применяют два метода люминесцентной микроскопии: флуорохромирования и флуоресцирующих антител.

Фотолюминесценция.
Представляет собой явление свечения объектов, которое возникает в результате поглощения объектом лучистой энергии. Вследствие некоторых причин свет люминесценции обладает большей длиной волны, чем поглощенный (правило Стокса). Поэтому люминесценцию выгодно возбуждать либо ультрафиолетовыми лучами (300—400 нм), либо сине-фиолетовыми. В обоих случаях возникает свечение в цветовой гамме всего (или большей части) видимого спектра. Этот вид люминесценции носит название наведенной (вторичной) в отличие от первичной — собственной флюоресценции, нередко проявляемой витаминами, многими пигментами, некоторыми жировыми веществами и антибиотиками, встречающимися в живых организмах, некоторыми продуктами нормального и патологического обмена.

Флуорохромы.
Красители, не вызывающие сильной окраски объектов в обычном свете, но флуоресцирующие при облучении ультрафиолетовыми лучами. Из синтетических флюорохро-мов наилучшие результаты дают акридин оранжевый, корифосфин, примулин, родамин, ФИТЦ (флюоресцеинизотиоцианат), которые обычно применяют в виде слабых водных растворов. Основными элементами для получения падающего на объект света возбуждения и условий для наблюдения свечения объекта являются источник света, позволяющий выделить из широкого спектра излучения требуемую длину волны, и система светофильтров.

Различается четыре группы светофильтров:

• светофильтры возбуждения служат для выделения из общего потока излучения источника света тех лучей, которые обеспечат возбуждение и свечение объекта; устанавливаются в ветви осветителя;
• запирающий светофильтр служит для срезания света возбуждения и пропускания только света люминесценции; устанавливается в наблюдательной ветви;
• сменные фильтры разные по назначению: фильтры для защиты глаз от попадания красных и инфракрасных лучей, а также теплозащитные фильтры; в отечественных микроскопах применяются фильтры из стекла БС8 для предохранения объектов от выцветания;
• светоделительная пластина служит для разделения падающего на объект светового потока (направление света от источника через объектив на объект) и светового потока, формирующего изображение (пропускание света, отразившегося от объекта и прошедшего через объектив). Светоделительная пластина обеспечивает необходимое спектральное разделение света возбуждения и света люминесценции: отражает 90% света в спектральной области возбуждения люминесценции (400—550 нм) и пропускает 90% света в спектральной области люминесценции объекта (500—700 нм).